Antibiotika an der 30S Untereinheit

Die Bindung von Antibiotika an der kleinen ribosomalen Untereinheit als dreidimensionale Strukturinformation zu erhalten ist bisher (8/2003) nur 2 Gruppen gelungen. Im Herbst 2000 wurde die Bindung von Spectinomycin, Streptomycin und Paromomycin von der MRC Gruppe veröffentlicht. Kurz darauf im Dezember folgten deren Tetracycline, Pactamycin, Hygromycin B Komplexe. Kurz darauf im April 2001 wurden unsere (MPG) Komplexe mit Edeine und Tetracycline publiziert.

Eine Übersicht der Bindungsstellen findet sich im folgenden Bild. Danach wird im Detail auf die einzelnen Antibiotika eingegangen.

INFO:

Unsere Kollaboration: Ada Yonath's Gruppen in Hamburg/GER (MPG-AGRS) und Rehovot (Weizm.Inst./IL), und F. Franceschi's (jetzt P. Fucini) Gruppe in Berlin(GER) (MPI-MG)
Dann P. Fucini's Gruppe in Frankfurt (GER) (Goethe-Uni/CEF)
Venki Ramakrishnan's Gruppe am MRC-LMB in Cambridge - homepage


Die Struktur der 30S Untereinheit (1I94) von Thermus thermophilus zusammen mit den Positionen für die gebundenen Anitbiotika Tetracyclin (rot, sekundäre Bindungsstellen orange; PDB 1I97), Edeine (lila; 1I95), Paromomycin (1FJG) und den Aminoglycosiden Streptomycin (1FJG), Spectinomycin (1FJG) und Hygromycin B (1HNZ).


Edeine (1I95, PubMed)

ist ein universelles Antibiotikum, d.h. es wirkt bei allen Organismen. Die theoretische Vorraussetzung dafür wäre eine starke Homologie der Bindungsstelle bzw. -Umgebung bei allen Organismen.
Und genau das konnte gezeigt werden. Die Basen der ribosomalen RNA an denen Edeine bindet sind universell konserviert.

Viele der Bindungspartner in der RNA sind nachweislich an der Bildung des 30S-Initiations-Komplexes beteiligt.

Die Bindungsstelle liegt in der Nähe der E(exit)-tRNA Stelle, der 'beta-tyrosine Teil' (der lange Arm) ragt jedoch bis hinüber zur P(peptidyl)-tRNA Stelle.

Dies hat zur Folge, das die mRNA nicht in der Art und Weise Binden kann, wie es nötig ist, um korrekt die tRNA's zu Binden um eine arbeitsfähiges 70S Ribosom zusammenzustellen. Man könnte sogar soweit gehen zu behaupten, Edeine blockiert den Weg der mRNA um den 'Hals' der 30S Untereinheit herum und hindert sie die Shine-delgarno Sequenz zu erreichen. Der im selben Artikel veröffentlichte Komplex der C-termimalen Domäne des Initations-Faktors 3 (IF3) mit der 30S Unterienheit, lässt weiter darauf schließen, das die korrekte Bindung des IF3 unter Anwesenheit von Edeine nicht möglich ist. Da aber bisher noch keine hochaufgelöste strukturelle Informationen eines vollständigen IF3 Moleküles an der 30S Untereiheit gebunden vorliegen, ist dieser Effekt noch nicht bewiesen.

Lage der Edein Position im 30S

Interessanterweise konnten wir neben der Edeine Dichte noch eine weitere starke Veränderung in der Struktur entdecken. Zwischen Helix 23 und Helix 24 der 16S RNA hat sich ein neues Basenpaar gebildet. Dieses hat vermutlich einen noch größeren Einfluss auf die Bindung des vollständigen Initiations Faktors 3 als Edeine selbst.
Der Haupteffekt dieses neuen Basenpaares liegt jedoch in der 'Versteifung' der ansonsten hochflexiblen Platform Region des 30S. Dadurch sind zur Bildung des Initiationskomplexes nötige Konformationsänderungen um einiges eingeschränkt.



Ein detaillierter Blick auf das Bild oben: die Elektronen Dichte des induzierten Basen-paares zwischen Helix 23 und 24.

Eine kleine Animation, die die Konfor-mation der16S rRNA vor and nach dem Binden von Edeine zeigt.


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Tetracycline (1I97, PubMed)

sind die ersten sogenannten, seit den frühen 40er Jahren eingesetzten, Breitbandantibiotika. Sie wirken bakteriostatisch gegen eine Vielzahl unterschiedlicher Bakterien.
Da diese Moleküle sich häufig in Knochen und Zähnen ablagern führt ein Nebeneffekt, eine ausgeprägte Fluoreszens, zu einer verbreiteten Anwendung ausserhalb der Bakterien-bekämpfung.
→ siehe Resistenzproblem

Der 30S-Tetrazycline-Komplex ergab, wie erwartet (biochem. Daten) mehrere Bindungsstellen. Das Molekül ist an seiner primären Bindungsstelle unter zur Hilfenahme eine Magnesium(2+)-Ions (hellblau) an den Zucker-Phosphat-Backbone der Helix 34 gebunden, der Umgebung der A-Site der A-tRNA.
Biochemisch wurde nachgewiesen, dass es so die Bindung der aa(aminoacytylated)-tRNA nicht verhindert, wohl aber so modifiziert, das der beginnende Prozess der Proteinbiosynthese gestoppt wird weil die aa-tRNA auf der Seite der 50S Untereinheit nicht die korrekte Orientierung besitzt um eine Peptidbindung zu ermöglichen.


Eine weiteres Tetrazyklin Molekül bindet in einer engen Tasche zwischen Protein S17 und den Helices 11 und 27. Die Bindung zu S17 mag weniger wichtig sein, da dieser Teil des Proteins nur bei thermophilen Bakterien vorkommt.
Die Bindung zwischen 'Plattform' (H27) und 'Body'(H11) kann die Bewegung der Plattform während des Prozesses der Proteinbiosynthese deutlich einschränken.

Helix 27 und Umgebung wandeln sich nach biochemischen Erkenntnissen zwischen zwei verschiedenen Konformationen, es liegt klar auf der Hand, daß dieser Wechsel zwischen zwei Zuständen nicht mehr, oder nur erschwert möglich ist, wenn eine Seite des 'Schalters' festgehalten wird.

Diese zweite Position wurde auch von der Cambridge Gruppe gefunden. Wir selbst haben noch weitere 4 Tetrazyklin Moleküle an unserem 30S gefunden.

Vier weitere, weniger stark besetzte, Positionen wurden in unserem 30S-Tetrazyklin-Komplex noch gefunden. Da deren bakteriostatische Wirkung nicht eindeutig klar ist, werden sie hier nur kurz aufgeführt.

345,6
Position 3 bindet am Protein S4, dieses ist eines der sog. 'early-binding proteins', ein Effekt von Tetrazyklin auf den frühen Zusammenbau der 30S Untereinheit wäre also denkbar.
Im 'Groove' von H40 sitzt das vierte Molekül. Hier gibt es bisher noch keine Idee für irgendeinen Effekt.
Schließlich noch Molekül 5 und 6, beide binden am 'Kopf'. Nr.5 am sogenannten Hals, Helix 28 der einzigen direkten Verbindung zwischen 'Kopf ' und 'Körper', zusätlich hat es Kontakt mit dem Protein S7. Nr.6 hat einen Kontakt zum langen Arm vom Protein S9. Beide Moleküle können Konformationsänderungen innerhalb der Kopfregion behindern (sind bekannt bei der Translokation), ob es dabei zu einem bakteriostatischen Effekt kommt bleibt aber unklar.

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Paromomycin, Streptomycin, Spectinomycin Pactamycin, Hygromycin B


Paromomycin (1FJG)
ist ein Aminoglycosid, dass ein Ansteigen der 'Fehlerrate' des Ribosoms verursacht. Es bindet in den 'major-groove' von Helix 44 der 16S RNA, unterhalb des Dekodierungszentrums. Die Wirkung von Paromomycin beruht wesentlich auf einer Konformationsänderung in Helix 44. In der Anwesendheit des Antibiotikums werdem zwei der Basen in Helix 44 'heruasgeklappt', so dass sie direkt zur A-site weisen. Die Idee ist, dass diese Basen damit ihre 'natürliche' Orientierung einnehmen, die sie auch im Falle der Bindung einer korrekten A-site tRNA, also jener die dem Codon auf der mRNA entspricht, haben. Damit kann das Ribosom aber nicht mehr besonders gut zwischen korrekten und falschen tRNA's unterscheiden, die Affinität für 'non-cognate' tRNA's wird also deutlich erhöht. Auf diese Art wird Paromomycin also die Fehlerrate in die Höhe schnellen lassen.

Streptomycin (1FJG)
bindet an verschiedene Helices sowie einer einzelnen Aminosäure des Proteins S12. Es sorgt offensichtlich dafür, das das 30S bevorzugt die sogenannte 'ram-state' (Ribosome-Ambiguity-Mutation) Konformation einnimt, was die Wirkung von Hyper-Akkuraten Mutationen von S12 kompensieren kann. Daraus erfolgt eine höhere Fehler-Rate, die - wie im Falle von Paromomycin - durch eine erhöhte Affinität von 'non-cognate' tRNAs an der A-site. bewirkt wird

Spectinomycin (1FJG)
stört die Translokation der p(peptidyl)-tRNA von der A-Site zu der P-Site. Es bindet hauptsächlich am Ende von Helix 34, in der Nähe der 'Nacken-'Helix 28 sowie Protein S5. Der Mechanismus bleibt ein wenig im Dunklen, die Vermutung liegt aber nahe, dass Spectinomycin die Drehung des Kopfes unterdrückt. entweder direkt oder indem eine spezifische Konformation von Helix 34 fixiert wird. Die Translokation der peptidyl-tRNA von der A-site zur P-site erfordert aber eine Bewegung des Kopfes. Konsequenterweise stört Spectinomycin die Translokation, was gut mit biochemischen Experimenten übereinstimmt.

Pactamycin (1HNX)
ist ebenso wie Edeine ein universelles Antibiotikum, das die Proteinbiosynthese in allen Organismen stört. Pactamycin bindet im oberen Teil der Platform, in der Nähe der 'Schlucht', in der all drei tRNA Moleküle andocken. Ursprünglich hatte man angenommen, dass Pactamycin primär in der P-site bindet, die strukturellen Ergebnisse haben aber gezeigt, dass Pactamycin eher in der E-site bindet. Die mRNA wird durch Pactamycin stark verschoben, die letzte Base des E-site Codons ist um etwa
12Å gegenüber der nativen Struktur verschoben. Als Folge behindert das Antibiotikum sowohl die produktive Bindung der Initiator-tRNA als auch den Weg der mRNA durch das Ribosom. Als Konsequenz wird die Bildung des Initiationskomplexes verhindert. Natürlich wird Pactamycin auch die Kontakte der E-site tRNA mit dem Codon der mRNA unterdrücken. Die wird aber wahrscheinlich nicht wesentlich zur antimikrobiellen Aktivität beitragen, da Pactamycin - wie auch Edeine - nicht an aktive Ribosomen bindet.


Hygromycin B (1HNZ)
besitzt wie alle anderen Aminoglycoside eine einzelne Bindungsstelle, in der 'Major Groove' von Helix 44 unterhalb des 'decoding centers'. Da die Wechselwirkungen auschliesslich die Basen aber nicht den RNA 'backbone' betreffen, ist die Bindung stark Sequenzabhängig.

Der Mechanismus ist zwar nicht offensichtlich, aber es scheint wahrscheinlich, dass Hygromycin B eine Konformationsänderung, die für die Translokation notwendig ist, unterdrückt. Auf diese Weise würde Hygromycin B die Verschiebung der tRNA von der A-site zur P-site verhindern, was gut mit biochemischen Daten übereinstimmt.


Wir wollen uns nicht mit fremden Lorbeeren schmücken daher nur die "binding-site" von Hygromycin B, stellvetretend für die 30S-Antibiotika Komplexe der Cambridge Gruppe.
Weitere Informationen zu diesen Antibiotika, sowie Animationen der verschiedenen Zustände der 30S Untereinheiten findet man auf der Homepage der Cambridge Gruppe. (only in english).

Eng Verbunden mit den Antibiotika ist natürlich das Problem der zunehmenden Resistenzen und damit zunehmenden Wirkungslosigkeit der gängigen Antibiotika. Mehr über Antibiotika-Resistenz auf einer Extra-Seite.

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