Pleuromutilin Antibiotika an der 50S Untereinheit von
Deinococcus radiodurans

Clitopilus scyphoides


Clitopilus scyphoides, ein essbarer Pilz. (Foto von Markus Wilhelm. Weitere Pilzinfos unter: external linkwww.pilze-basel.ch )

Tiamulin ist ein 1976 (Egger and Reinshagen, 1976b) vorgestelltes derivat des natürlichen Antibiotikums Pleuromutilin (Kavanagh et al., 1951), welches ein Produkt des Pilzes Pleurotus mutilus (heutzutage umbenannt in Clitopilus scyphoides, siehe rechts) ist.

Tiamulin ist ein weit verbreitetes und wegen seiner guten Wasserlöslichkeit häufig verwendetes Antibiotikum in der Tierzucht.
Bisher hat es kein Pleuromutilin-Antibiotika bis zur Anwendung beim Menschen geschaft. Drastisch zunehmende Resistenzen bei krankmachnden Bakterien haben das in den frühen 80ern erlahmte Interesse an neuen Antibiotika der Pleuromutilin Klasse wieder aufkeimen lassen [Bacque et al., 2002, 2003; Brooks et al., 2001; Pearson et al., 2002; Springer et al., 2003].

Nach vielen anderen Antibiotika(-Klassen) ist es uns nun auch gelungen, für eine Auflösung von 3.5A, die Bindung von Tiamulin an der großen ribosomalen Untereinheit (50S) von Deinococcus radiodurans aufzuklären (F. Schlünzenet. al. Molecular Microbiology (2004) siehe Publikationsliste ).

Rechts:Tiamulin bindet im 'Peptidyl-Transferace-Center' (PTC) am Eingang des ribosomalen Tunnels. Dabei ist die dreifache Ringstruktur des Mutilin Kerns fest in einer 'Tasche' oder 'Höhle' an der A-tRNA Bindungs-stelle fest gebunden (bestehend aus G2061, A2451, C2452, A2503, U2504, G2505, U2506 --E.coli Nummerierung). Die Extension geht vom Mutilin Kern hinüber auf die andere Seite des Tunneleingangs wo sie mit der Bindungs-stelle der P-tRNA überlappt.
Blau: Hydrophobische Bindungspartner der 23S rRNA
Purple: Bindungspartner von Wasserstoff - Brückenbindungen

Tiamulin verhindert also direkt die Bildung der Peptidbindung (In Bestätigung früher biochemischen Untersuchungen [Drews et al., 1975; Egger and Reinshagen, 1976a; Hodgin and Hogenauer, 1974; Hogenauer, 1975]). Obwohl die A- und/oder P-tRNA vielleicht noch binden können, wird aber zumindest den anhängenden Aminosäuren nicht mehr die zur Bildung der Peptidbindung nötige Konformation erlaubt.

Ist der Prozess der Proteinbiosynthese erstmal in Gange gelingt es Tiamuliun nicht mehr zu binden (Auch biochemisch nachgewiesen von (Dornhelm and Hogenauer, 1978)), da die A- oder P-Stelle der tRNA, also mindestens eine 'Hälfte' der Bindungsstelle von Tiamulin dann besetzt ist.

Rechts: Die Überlappung der Bindungsstelle von Tiamulin mit denen der A- und P-tRNA-Enden. (Orange: Tiamulin, blau: A-CCPuro, beige: P-CCPuro)

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Bindung an der 23S rRNA

Tiamulin ist durch ein extensives Netzwerk von hydrophoben Wechselwirkungen, ausschliesslich an die 5. Domäne der 23S RNA (namentlich G2061, A2062, C2063, A2451, C2452, A2503, U2504, G2505, U2506, U2585 and C2586 ) und mit Wasserstoff-Brückenbindungen zu G2061 und U2585 gebunden (Nummerierung der RNA nach E.coli ).

Oben:
Tiamulin ist aufgebaut aus einem 3-Ring-Kern, welcher aus einem 'cyclo-pentanone', 'cyclo-hexyl' und 'cyclo-octane' besteht, und einer (((2-(diethylamino)ethyl)thio)-acetic acid) Seitenkette am C14 des Octane-Rings. Diese Seitenkette ist Unterschiedlich bei den verschiedenen Antibiotika der Pleuromutilin Klasse.
Wasserstoffbrückenbindungen zur 23S rRNA sind möglich zur OH-Gruppe am C11 des octane-Rings sowie zum doppelt gebundenen O und dem Schwefel der Seitenkette.


Rechts:
Übersicht der Tiamulin-Bindungspartner von der 23S rRNA, dazu sind Ergebnisse biochemischer Experimente angezeigt.

Bild oben:
Struktur von Tiamulin und den Bindungspartnern der 23S rRNA
(A) Darstellung der lokalen Umgebung von Tiamulin (orange) in einer Orientierung die um etwa 10 Grad von der publizierten (Schlünzen et al.) abweicht. Die rRNA Nukleotide sind stahlblau oder weiss gehalten, für Wasserstoff-Brücken (grün gestrichelt) Bindungspartner bzw. Bindungen über hydrophobische Wechselwirkungen. Um halbwegs die Übersicht zu behalten wurde auf eine Darstellung der rRNA Nukleotide, welche keine Bindung mit dem Tiamulin Molekül eingehen verzichtet. (B) Eine um 90 Grad gegenüber (A) rotierte Ansicht.

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Vergleich der Bindungstelle mit anderen ribosomalen Antibiotika

Rechts:
Tiamulin überlappt in seiner Bindungsstelle mit anderen Antibiotika sowie der Bindungsumgebung der A- und P-tRNA.
Orange: Tiamulin
blau: A-CCPuro
beige: P-CCPuro
gelb: Dalfopristin (Streptogramin A)
purple: Chloramphenicol
hellgrau: Clindamycin
grün: Quinopristin (Streptogramin B)
rot: Erythromycin (Makrolide)
Aus: [Bashan et al., 2003; Harms et al., 2004; Schlunzen et al., 2001; Schlunzen et al., 2003]

ca 90Grad gedreht

Interessanterweise sieht man auf der rechten Abbildung deutlich, wie eng die Positionen der verschiedenen Antibiotika übereinander liegen. So lässt sich leicht verstehen, das einige Resistenz-Mutationen der rRNA gleich gegen mehrere Antibiotika wirken. Unten:
Obwohl Tiamulin und Dalfopristin (Streptogramin A) die Mehrzahl der Bindungspartner mit der 23S RNA gemeinsam haben zeigt der lange Seitenarm, welcher zum Großteil identisch ist (-CH2-CH2-CH-N-(CH2-CH3)2), in verschiedene Richtungen.
Vergleicht man die umgebenden Nukleotide der 23S RNA beider Antibiotika so finden sich nur 2 signifikante Unterschiede: Zum einen U2585, welche im Streptogramin Komplex nahezu um 180Grad rotiert zur nativen (ähnlich Tiamulin) Struktur gefunden wurde. Zum anderen für A2062, welche eine spezifische Orientierung einnehmen muss um die gleichzeitige Bindung von Streptogramin A und B zu ermöglichen (siehe auch unsere Seite über Streptogramins).

Die Überlappung von Dalfopristin und Tiamulin brachte uns auf die Idee doch mal zu versuchen Tiamulin mit Streptogrammin B (Mikamycin) zu kombinieren, in der Hoffnung, vielleicht eine verstärkte Bindung des Streptogrammin B zu erhalten. Leider hat es nicht geklappt, Tiamulin war klar zu erkennen, aber weit und breit kein Streptogramin B. Dies darf gleichzeitig als weiterer Nachweis für die Wichtigkeit der Orientierung von A2062 gewertet werden.

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Überlappende Bindingsstellen und mögliche Antibiotika-Hybride

Der Vergleich der Bindungsstelle von Tiamulin mit anderen PTC-bindenden Antibiotika (Chloramphenicol, Clindamycin, und Streptogramine) kann von Nutzen sein für die Entwickling von 'hybridisierten' Antibiotika mit erhöhter Wirksamkeit, welche letztendlich aus Kombinationen bekannter Moleküle bestehen.

So ließe sich vielleicht der Zucker(Ring) von Clindamycin an den C12-Arm von Tiamulin koppeln, der Platz wäre da und die Bindungsumgebung bekannt (siehe unten rechts).
Eine Kombination der Seitenkette Tiamulins mit Quinopristin (Streptogramin B, siehe rechts) würde zwar die gleichzeitige Bindung von Dalfopristin verhindern, könnte aber vielleicht zu einer verstärkten Bindung Quinopristins alleine führen.
Schließlich liegt das Ende von Chloramphenicol in Wasserstoff-Brücken-Distanz zu der Methylgruppe am C6 des 'cyclo-hexyl' -Ringes.


Tiamulin und Quinopristin
Tiamulin und Chloramphenicol
Tiamulin und Clindamycin
So oder so, dies sind natürlich nur grobe Vorschläge, die wir (Physiker) aus unseren Beobachtungen und Ergebnissen entwickelt haben. Dazu ist der Fehler ind der Position der Atome bei Auflösungen zwischen 3 und 3.5A nicht zu vernachlässigen. Nichtsdestotrotz beweisen die verschiedenen Ribosom-Antibiotika-Komplexe aber auch, dass die lokale RNA durchaus flexibel ist bei der Bindung von Molekülen. Die Ergebnisse geben also einen guten Einblick in die spezifische Wirkungsweise der Pleuromutilin- Antibiotika, und bilden sicherlich eine weitere Hilfe in der Entwicklung von Pleuromutilin-Derivaten, die letztlich auch für den Menschen nutzbar sein können.


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